Universität Hamburg

Fachbereich Chemie

Wiebke Havemeister   (AK Steinhart)

Teilreinigung und Charakterisierung des Enzyms Trimethylaminoxid-Demethylase aus Wittling (Merlangius merlangus)


Der im Rahmen der vorliegenden Dissertation entwickelte diskontinuierliche Trimethylaminoxid-Demethylase-Test (Standard-TMAO-ase-Test), bestehend aus der Trimethylaminoxid-Demethylase (TMAO-ase)-Reaktion und der Messung von Formaldehyd, ermöglichte eine schnelle, sichere und empfindliche Messung. Aufgrund der Ergebnisse der intrazellulären Lokalisierung kann TMAO-ase als lysosomales Enzym betrachtet werden, das an oder in den Lysosomen gebunden ist, und ebenfalls in der löslichen Fraktion auftritt. Das pH-Optimum und das Vorkommen der lysosomalen Enzyme (saure Phosphatase and a-Glucosidase) konnten dieses Ergebnis bestätigen. Die Untersuchung der Enzymverteilung auf die Organe zeigte, dass Wittling-TMAO-ase vor allem in der Niere in großen Mengen vorkommt. Daher wurden die Extraktionsversuche mit der Niere optimiert. Die Variationen der Extraktionsbedingungen - der Homogenisationstechniken, Temperatureinflüsse auf die Homogenisation und Extraktion, der Zusatz von Salz und verschiedenen Detergentien – hatte nur geringen Einfluss auf die extrahierte Enzymmenge. Lediglich mittels Detergentien (Triton X-100) wurde der extrahierbare Anteil des Enzyms erhöht. Bei der Extraktion und auch bei der Lokalisation zeigte sich, dass die TMAO-ase sowohl einen löslichen als auch unlöslichen, membrangebundenen Teil besitzt. Zahlreiche chromatographische Verfahren (Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie und Affinitätschromatographie an immobilisierten Chelaten mit Cu2+) wurden zur Reinigung der TMAO-ase angewandt, ohne den Reinheitsgehalt wesentlich zu erhöhen. Mit der Gelfiltration (Sepharose 4B und 6B) konnte der Wittling-Nieren-Extrakt in zwei Hauptfraktionen getrennt werden: eine hochmolekulare, membrangebundene Fraktion (ca. 2 Mill. Da) geringer Reinheit und eine lösliche Fraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich 150-600 kDa, die bis zu 5-fach aufgereinigt war. Teilgereinigte TMAO-ase zeigte ein Temperaturoptimum von 25°C und ein pH-Optimum von 4.5 - 5.0 im Standard-TMAO-ase-Test. Die lösliche und unlösliche Fraktion waren im Temperaturbereich von 30-40°C für 20 min hitzestabil, ab 40°C nahm die Aktivität der TMAO-ase stark ab. Die Aktivierungsenergie lag bei teilgereinigter TMAO-ase bei 5.2 bis 6.0 kcal/mol°K, je nach verwendetem Puffer.

Die isoelektrische Fokussierung von TMAO-ase-Extrakten und teilgereinigter TMAO-ase zeigte, dass TMAO-ase ihren pI-Wert im sauren Bereich hat. Durch die Entwicklung einer enzymspezifischen Färbemethode konnten vier definierte Banden eines teilgereinigten Nieren-Extraktes der TMAO-ase im pI-Bereich 6.2-6.6 zugeordnet werden, dieses deutet auf das Vorhandensein von Isoenzymen hin. Die Absicherung dieser Banden erfolgte durch parallele Silberfärbung und Messung der TMAO-ase Aktivität im Gel.

SDS-Elektrophorese unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen zeigte, dass sowohl die lösliche als auch die unlösliche Fraktion die gleichen Untereinheiten (4x103 –6.6x104 Da) besitzt, die daher sehr wahrscheinlich über SH-Gruppen verknüpft sind.

Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten, dass TMAO-ase die synthetisierten und charakterisierten Trimethylaminoxid-(TMAO)-Analogen N-Ethyldimethylaminoxid (EDMAO), N,N-Diethylmethylaminoxid (DEMAO), Triethylaminoxid (TEAO) unterschiedlich umsetzt, abhängig von sterischen Faktoren. TMAO und EDMAO wurden sehr ähnlich durch TMAO-ase umgesetzt (Km (TMAO) = 5.7-11.5 mM; Km (EDMAO) = 11.2 – 16.8 mM), während DEMAO und TEAO langsamer demethyliert bzw. deethyliert wurden.

Letzte Änderung am 29-Jun-2000 durch Webmaster  |  Impressum