Reinheitskontrolle von Marzipan mittels molekularbiologischer Methoden

Im Forschungsantrag wurde die Entwicklung von molekularbiologischen Methoden zur Reinheitskontrolle von Marzipan bzw. von Rohstoffen oder Zwischenprodukten als Ziel formuliert. Es sollten PCR-basierte Methoden zum Nachweis der Arten Aprikose, Pfirsich, Bergmandel, Erbse, Bohne, Lupine, Soja und Cashew entwickelt werden.

Zur Extraktion der DNA aus den Rohstoffen oder Rohmassen wurden vier Methoden entwickelt und speziell auf die Matrix der Rohmassen optimiert. Die Aufarbeitungen erlauben eine schnelle und Kostensparende Anwendung in der Routine. Durch Vergleichen von vier Parametern wurde in Validierungen die am besten geeignete Methode ermittelt (Kombination aus Isopropanolfällung und Silicaspinkartusche). Es wurden qualitative Endpunkts-PCR Methoden zum Nachweis der im Antrag erwähnten Arten Aprikose, Pfirsich, Erbse, Bohne, Lupine, Soja und Cashew etabliert. Ein spezifischer Nachweis der Bergmandel konnte nicht realisiert werden. In weiteren Forschungsarbeiten wären hier aufwendige Sequenzierungen nötig. Zusätzlich zu den im Antrag aufgeführten Pflanzenarten konnten spezifische Nachweise für Pistazie und Kichererbse entwickelt werden. Als Weiterentwicklung wurden Duplex-PCR Methoden entwickelt. Des Weiteren wurden PCR-RFLP-Methoden entwickelt. Die Anwendbarkeit für die Fragestellung wurde genauer am Beispiel einer Verunreinigung mit Bohnenanteilen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Verunreinigungen kleiner 10-% nicht sicher nachgewiesen werden können. Da unerwünschte Einträge in geringeren Konzentrationen vorkommen, sind die Methoden nur bedingt geeignet. Eine Quantifizierung mit der Experion-Kapillarelektrophorese nach einem spezifischen Restriktionsverdau ist prinzipiell für höhere Konzentrationen und Einsatz eines Internen Standards möglich.
Zur genauen Quantifizierung auch geringer Einträge sollten real-time PCR Methoden entwickelt werden. Es konnten Methoden zur Bestimmung von DNA aus Aprikose, Pfirsich, Erbse, Bohne, Lupine, Soja, Kichererbse, Pistazie und Cashew entwickelt werden. Zur Detektion wird SYBR Green I verwendet. An Beispielen wurde eine leichte Adaption der Methoden auf TaqMan-Sonden aufgezeigt. Alle Methoden wurden in aufwendigen Matrixkalibrierungen optimiert und validiert. In der Regel sind Bestimmungen bis ca. 0,1 % möglich. Anhand der ermittelten Daten wurden verschiedene Quantifizierungsmöglichkeiten untersucht. Abschließend wurde ein optimaler Analysengang zur Reinheitskontrolle von Marzipan vorgeschlagen. Dieser beinhaltet alle optimierten Arbeitsschritte von der DNA-Extraktion, über die qualitativen Nachweise bis zur am besten geeigneten Auswertungsmethode.


Ein zusammenfassender Bericht kann hier eingesehen werden:
Schlussbericht.pdf